ΒΙΝΤΕΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΤΕΚΜΗΡΙΩΣΗΣ ΕΛΕΓΧΩΝ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ
Η απομυθοποίηση της "απομόνωσης" των ιών μέσω κυτταροκαλλιέργειας στην ιολογία;
*του Jamie Andrews*
Υλικά και Μέθοδοι
Κυτταρική καλλιέργεια
Κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού (HEK293T ATCC CRL-3216) σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 6 φρεατίων στο πέρασμα 5-8 σε συγκέντρωση 1x106 ανά 5 mL και αναπτύχθηκαν για 3 έως 4 ημέρες στους 37°C, 5% CO2 σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα. Οι συνθήκες είχαν ως εξής:
1. DMEM, 10% FBS, 1 x P/S
2. DMEM, 2% FBS, 1 x P/S
3. DMEM, 2% FBS, 2 x P/S
4. DMEM, 2% FBS, 3 x P/S
5. DMEM, 1% FBS, 1 x P/S
6. DMEM, 1% FBS, 2 x P/S
7. DMEM, 1% FBS, 3 x P/S
Την ημέρα 3 ή την ημέρα 4 της ανάπτυξης, τα κύτταρα απεικονίστηκαν στο 20x με ένα σύστημα απεικόνισης πυρήνα Evos XL.
Μετά την απεικόνιση των κυττάρων, οι καλλιέργειες πλύθηκαν με PBS, στη συνέχεια προστέθηκε 1 mL TryplE για να διαχωριστούν τα κύτταρα από τους δίσκους. Μετά από 3 λεπτά, προστέθηκαν 5 mL DMEM + 10% FBS + 1 x P/S, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 3 λεπτά. Τα σφαιρίδια των κυττάρων επαναιωρήθηκαν με 5 mL DMEM + 10% FBS + 1x P/S και η βιωσιμότητα υπολογίστηκε με τον αυτόματο μετρητή κυττάρων Countess 3 FC (Invitrogen).
Αφού καταγράφηκε η βιωσιμότητα, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 3 λεπτά, στη συνέχεια το DMEM χύθηκε και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 300-500ul τριζόλης και αποθηκεύτηκε στους -80°C έως περαιτέρω ανάλυσης.
ΒΙΝΤΕΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Λήψη αποθεμάτων
Ο τεχνικός δείχνει τη ρύθμιση του εργαστηρίου και μετακινείται προς το κάλυμμα ροής, όπου θα χειριστούν όλα τα αντιδραστήρια. Το κάλυμμα ροής είναι βαθμονομημένο σύμφωνα με τις ρυθμίσεις του πρωτοκόλλου για την αποφυγή τυχόν μόλυνσης. Λαμβάνεται απόθεμα όλων των αντιδραστηρίων που δείχνουν τα κύτταρα (Κυτταρική Γραμμή), τo μέσο κυτταροκαλλιέργειας (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), ορό εμβρύων βοοειδών (FBS), πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (P/S), αμφοτερικίνη, τριζόλη, θρυψίνη και μια επιλογή από πιπέτες και μύτες.
Επιβεβαίωση ότι τα κύτταρα έχουν υποστεί θρυψινοποίηση
Θρυψινοποίηση της Κυτταρικής Γραμμής σε καλλιέργεια για την αποκόλληση των προσκολλημένων κυττάρων από την επιφάνεια του δίσκου καλλιέργειας πριν από την καταμέτρηση και τη σπορά.
Διάλυμα θρυψίνης - EDTA (συνήθως 0,25%)
Αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) ή άλλο ισορροπημένο διάλυμα άλατος
Μέσο κυτταροκαλλιέργειας (με ορό για την αδρανοποίηση της θρυψίνης)
Αιμοκυτταρόμετρο ή αυτοματοποιημένος μετρητής κυττάρων
Φυγόκεντρος
Αποστειρωμένες πιπέτες
Φιάλες ή δίσκοι καλλιέργειας
Στη συνέχεια, τα κύτταρα μεταφέρονται στο μικροσκόπιο για να επαληθευτεί ότι έχουν αποκολληθεί από το δίσκο και ότι κινούνται ελεύθερα.
Φυγοκέντρηση σε σφαιρίδια για μέτρηση κυττάρων
Μετά την θρυψινοποίηση ή με άλλο τρόπο αποκόλληση των κυττάρων από ένα δίσκο καλλιέργειας, το κυτταρικό εναιώρημα είναι συχνά αραιό. Η φυγοκέντρηση εξαναγκάζει τα κύτταρα να κινηθούν στον πυθμένα ενός σωλήνα, συγκεντρώνοντάς τα σε ένα σφαιρίδιο, το οποίο κάνει τα επόμενα βήματα όπως η εκ νέου εναιώρηση ή η καταμέτρηση πιο διαχειρίσιμη και ακριβής
Επαναιώρηση σφαιριδίων κυττάρων
Το υπερκείμενο (το οποίο περιλαμβάνει θρυψίνη, ορό και άλλα συστατικά του μέσου καλλιέργειας) μπορεί να αφαιρεθεί μετά τη φυγοκέντρηση. Αυτό το βήμα είναι κρίσιμο για:
Εξουδετέρωση της θρυψίνης για την πρόληψη κυτταρικής βλάβης.
Αφαίρεση υπολειμμάτων ή νεκρών κυττάρων που μπορεί να επηρεάσουν την καταμέτρηση ή την έναρξη νέας καλλιέργειας.
Αλλαγή μέσων ή προετοιμασία κυττάρων για διαφορετικά διαλύματα ή buffer που απαιτούνται για μεταγενέστερες εφαρμογές.
Μετά την εκ νέου εναιώρηση, τα κύτταρα μετρώνται χρησιμοποιώντας τον αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων Countess 3 FC (Invitrogen).
Σπορά σε δίσκους 6 φρεατίων, 1 εκατ. ανά φρεάτιο
Σπορά των κυττάρων:
Διανομή του υπολογιζόμενου όγκου του κυτταρικού εναιωρήματος ώστε να υπάρχουν 1x106 ανά 5 mL συγκέντρωση σε κάθε φρεάτιο. Χρησιμοποιείται μια πιπέτα με άκρα μιας χρήσης για ακρίβεια και για να αποφευχθεί διασταυρούμενη μόλυνση.
Εάν το κυτταρικό εναιώρημα δεν είναι στη σωστή συγκέντρωση, προσαρμογή του όγκου ανάλογα ή αραίωση του κυτταρικού εναιωρήματος για τη διευκόλυνση του υπολογισμού.
Προσθήκη περισσότερου μέσου:
Μετά την προσθήκη των κυττάρων, προσθήκη επιπλέον μέσου καλλιέργειας σε κάθε φρεάτιο για να φτάσει στον επιθυμητό όγκο. Για τα περισσότερα προσκολλημένα κύτταρα, προσθήκη αρκετού μέσου για να φτάσει στα 5 ml ανά φρεάτιο.
Μεταβλητές συγκεντρώσεις δοκιμής εναπόθεσης
Εναπόθεση σε δίσκους όλων των αντιδραστηρίων με ποικίλες συγκεντρώσεις ορού εμβρύων βοοειδών και πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης σε συγκέντρωση 1x106 ανά 5 mL σε κάθε φρεάτιο.
1. DMEM, 10% FBS, 1 x P/S
2. DMEM, 2% FBS, 1 x P/S
3. DMEM, 2% FBS, 2 x P/S
4. DMEM, 2% FBS, 3 x P/S
5. DMEM, 1% FBS, 1 x P/S
6. DMEM, 1% FBS, 2 x P/S
7. DMEM, 1% FBS, 3 x P/S
Επώαση και Μικροσκόπηση
Οι κυτταρικές γραμμές στους δίσκους αναπτύχθηκαν για 3 έως 4 ημέρες στους 37⁰ C, 5% CO2 σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα και στη συνέχεια εξετάστηκαν στο μικροσκόπιο για να επαληθευτεί αρνητικός έλεγχος με 10% FBS ως μέσο ανάπτυξης και δίσκους δοκιμής ποικίλης συγκέντρωσης.
Ζωντανή μικροσκόπηση σε φιάλη αποθέματος 10% FBS
Η φιάλη αποθέματος 10% FBS για τον δίσκο αρνητικού ελέγχου τίθεται κάτω από το μικροσκόπιο. Ο τεχνικός την περιγράφει ως σχεδόν συρρέουσα, πράγμα που σημαίνει ότι τα κύτταρα έχουν αναπτυχθεί τόσο ώστε να αγγίζουν το ένα το άλλο, αλλά ο τεχνικός δείχνει τα κενά στην κυτταρική γραμμή για να δείξει ότι υπάρχει ακόμη χώρος για ανάπτυξη. Αυτό δείχνει ότι τα κύτταρα αναπτύχθηκαν με μια υγιή συρροή και όχι υπερβολικά.
Στη συνέχεια επισημαίνουν μερικά αιωρούμενα κύτταρα, αλλά καταλήγουν στο ότι αυτή θεωρείται μια φυσιολογική και υγιής καλλιέργεια. Περιγράφουν πως όταν η φιάλη είναι λιγότερο συρρέουσα, μπορείτε να δείτε λιγότερα από αυτά τα αιωρούμενα κύτταρα, αλλά και πάλι αυτό θεωρείται μια κανονική και υγιής κυτταρική γραμμή.
Στη συνέχεια, δείχνουν τη σειρά με την οποία απλώνονται οι δίσκοι αρνητικού ελέγχου επάνω αριστερά και στη συνέχεια οι μεταβαλλόμενες συγκεντρώσεις σε άλλα φρεάτια.
Ζωντανή μικροσκόπηση σε δίσκους δοκιμής αρνητικού ελέγχου
Πρώτα κοιτάζουν τον αρνητικό έλεγχο με 10% FBS, όπου τον περιγράφουν ως συρρέων. Υποδεικνύουν τους χώρους όπου δεν είναι 100% συρρέων δείχνοντας ότι τα κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν και δεν είναι υπεραναπτυγμένα. Επισημαίνουν μερικά αιωρούμενα κύτταρα παρόμοια με την απεικόνιση της φιάλης αποθέματος.
Στη συνέχεια, εξετάζουν τον δίσκο δοκιμής με 2% FBS, τον περιγράφουν ως σχεδόν συρρέων, η μορφολογία φαίνεται πολύ διαφορετική. Υποδεικνύουν καθαρές πλάκες στην κυτταρική γραμμή από λυμένα κύτταρα, συσσωρεύσεις και συγκύτια, πολλά περισσότερα επιπλέοντα νεκρά κύτταρα, φουσκωμένα κύτταρα. Λένε ότι υπάρχει περιθώριο ανάπτυξης αν μπορούσαν, υποδηλώνοντας και πάλι ότι αυτή η μορφολογία στον δίσκο δεν ήταν αποτέλεσμα υπερανάπτυξης.
Ακολουθεί ο 2% FBS με 2 x πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη. Σημειώνουν πλάκες, φουσκωμένα, νεκρά κύτταρα, συσσωρεύσεις και συγκύτια και υποδηλώνουν ότι υπάρχουν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά σε συνδυασμό με άλλες εργασίες που δείχνουν το Κυτταροπαθητικό Αποτέλεσμα (CPE).
Ο τεχνικός επισημαίνει ότι στους δύο δίσκους δοκιμής μειωμένου FBS υπάρχει ακόμα άφθονο θρεπτικό μέσο, καθώς το χρώμα είναι ακόμα κόκκινο.
Ζωντανή μικροσκόπηση δίσκου δοκιμής συγκέντρωσης 0,5 εκατομμυρίων κυττάρων
Για να εκτιμηθεί και να συγκριθεί η πυκνότητα σποράς των κυττάρων, οι δίσκοι χρησιμοποιήθηκαν στο ήμισυ της συγκέντρωσης των κυττάρων, όπως μετρήθηκε από τον αυτόματο μετρητή, τον Countess. Εάν η υψηλότερη πυκνότητα σποράς προκαλούσε οποιουδήποτε είδους λιμοκτονία θρεπτικών ουσιών λόγω του συνωστισμού θα περίμενε κανείς δραστικές διαφορές από την παρατηρούμενη μορφολογία σε αυτόν τον δίσκο.
Ο τεχνικός περιγράφει αυτούς τους δίσκους πως έχουν τα ίδια ακριβώς μορφολογικά χαρακτηριστικά που αποδίδονται στο Κυτταροπαθητικό Αποτέλεσμα όπως παραπάνω. Επισημαίνουν το στρογγύλεμα, το φούσκωμα, τα συγκύτια, τους σχηματισμούς πλάκας και τα επιπλέοντα/νεκρά κύτταρα, όλα χαρακτηριστικά που περιγράφονται ως "Μολυσμένα με ιό" σε επιστημονικά έγγραφα που υποβλήθηκαν ως μέρος της περιγραφής εργασίας για το πρότζεκτ.
Σημειώνουν ότι υπάρχει άφθονος χώρο εάν τα κύτταρα ήθελαν να αναπτυχθούν, ότι δεν υπάρχει αναστολή επαφής και πως τα μέσα είναι κόκκινου χρώματος, γεγονός που δείχνει ότι έχουν απομείνει ακόμη πολλά θρεπτικά συστατικά, παρόλα αυτά στο 2% FBS με 1 x πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη όλα τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του Κυτταροπαθητικού Αποτελέσματος παρατηρούνται στις καλλιέργειες της δοκιμής...
0minus_Prime: Εδώ πρέπει να τονίσουμε πως στην ιολογία, το Κυτταροπαθητικό Αποτέλεσμα (CPE) ισοδυναμεί με την "απομόνωση" ενός ιού.
Βλέπουμε όμως στο πείραμα αυτό πως το ίδιο αποτέλεσμα εμφανίζεται και σε κυτταροκαλλιέργειες ΧΩΡΙΣ "ιικό δείγμα", απλά από τον συνδυασμό μείωσης του FBS ή/και της αύξησης της συγκέντρωσης των αντιβιοτικών πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη...
Αυτό σημαίνει πως τα πειράματα "απομόνωσης" ιών είναι στην καλύτερη περίπτωση παραπλανητικά και "στημένα" και πως η ίδια η ύπαρξη των ιών - ιοσωματίων τίθεται πια - με εργαστηριακές αποδείξεις - υπό σοβαρή αμφισβήτηση...